Плазмидные носители для эффективной интеграции генетических конструктов в геномы низших и высших эукариот

Название разработки

Плазмидные носители для эффективной интеграции генетических конструктов в геномы низших и высших эукариот.

Новизна

Применение этой системы как экспериментальной платформы для тестирования создаваемых библиотек первичных элементов в клетках дрожжей и человека позволяет добиться высокой повторяемости результатов тестов, что было ранее невозможно достичь, используя традиционные носители, интегрирующиеся в случайные места генома.

Назначение

Сконструированное биологическое устройство будет использовано в создании генетических тест-систем для исследования процессов репарации ДНК и функционирования генома человека.

Описание, характеристики

Используя полученные ранее данные, создано биологическое устройство – плазмидные носители для эффективной интеграции генетических конструктов в геномы низших и высших эукариот. Эти носители будут использоваться как экспериментальные платформы для тестирования создаваемых библиотек первичных элементов в клетках дрожжей и человека. Показано, что плазмидный носитель, используемый авторами, может служить как надежное средство для интеграции изучаемых генетических конструктов в определенное место в геноме клеток млекопитающих. Вследствие применения этой системы авторы добились высокой повторяемости результатов тестов, что было ранее невозможно достичь, используя традиционные носители, интегрирующиеся в случайные места генома. Данное свойство этой экспериментальной платформы очень пригодится при тестировании библиотек первичных элементов. На данный момент используются две отдельные платформы: одна для клеток дрожжей и вторая для клеток млекопитающих, в том числе человека. В перспективе планируется объединить эти две платформы в одну и создать плазмидный носитель, эффективно интегрирующийся в клетки высших и низших эукариот без какой-либо дополнительной модификации. Осуществлено техническое обоснование такого носителя и создан план его сборки из различных плазмидных компонентов. При выборе прототипов для библиотеки был проведен первоначальный скрининг нескольких дрожжевых промоторов с целью сравнить их транскрипционную активность. Среди трех протестированных промоторов (pGPD, pTEF1 и pTEF2) первый обладал наивысшей активностью. Авторы разработки попытались улучшить транскрипционную активность pGPD еще больше, создав полусинтетический вариант, используя активационные последовательности других промоторов, описанные в литературе. Однако полусинтетические варианты имели активность, сравнимую с изначальным вариантом. Это свидетельствует о том, что pGPD промотор может иметь в своей структуре некие ранее не описанные элементы, предотвращающие влияние соседних к нему участков генома на его транскрипционную функцию. В связи с этим, в качестве прототипа авторы использовали нативный pGPD промотор (а также pTEF1 и pTEF2), инкорпорировали в них специфические последовательности ДНК и создали библиотеку дочерних промоторов с регулируемой транскрипционной активностью, где модуляция может производиться с помощью белка-репрессора TetR. Для применения в клетках млекопитающих были созданы варианты pEF-1α промотора с добавлением мотивов XCPE, INR, MTE и DPE, а также заменой нативного интрона на интрон из гена β-глобина кролика. Эти варианты показали разнонаправленные изменения транскрипционной активности в сравнении с изначальным вариантом в зависимости от типа клеток, в которых осуществлялась экспрессия. Несмотря на то, что данные литературы в целом свидетельствуют об увеличении активности промоторов после добавления вышеозначенных мотивов, полученные результаты говорят, что, видимо, их эффект не универсален и на него может влиять структура конкретного используемого промотора, а также тип клеток. Опираясь на эти данные, авторы использовали нативный вариант pEF-1α промотора для создания дочерней библиотеки элементов с регулируемой транскрипционной активностью в клетках млекопитающих. Это было осуществлено с помощью вставки специфических последовательностей ДНК вокруг позиции старта транскрипции промотора. Библиотека полностью синтезирована и готова к тестированию. 

Научная и практическая значимость

Созданные биологические структуры необходимы для эффективной интеграции генетических конструктов в геномы низших и высших эукариот как экспериментальные платформы. Улучшенные свойства полученных экспериментальных платформ на основе плазмидных носителей делают их незаменимыми для тестирования библиотек первичных элементов.

Преимущества перед известными аналогами

На данный момент неизвестны полные аналоги проектируемых библиотек первичных элементов синтетической биологии. Фонд Biobricks, являющийся, пожалуй, наиболее близкой аналогией содержит элементы оптимизированные в подавляющем своем большинстве для работы в клетках прокариот. Те немногие элементы, пригодные для использования в клетках эукариот, которые он содержит, не обеспечивают в полной мере запланированные функциональные возможности проектируемых  библиотек. Это делает их применение для исследований в биологии эукариот и, потенциально, в клинической практике довольно проблематичным.

Область применения

Медицина, математическое моделирование

Правовая защита

Объект авторского права. Научная статья: Two-dimensionality of yeast colony expansion accompanied by pattern formation. Nevozhai D., Samaniego-Evans J.,Agollah G.,Kuzdzal-Fick J.,Mehta P.,Balazsi G.,Chen L.,Noorbakhsh J.,Adams R.M.; PLoS Computational Biology; США.

Стадия готовности к практическому использованию

Выполнен прототип биологического устройства – плазмидные носители.

Авторы

Невожай Д.В.